JIS K 7002:1988 工業用グルコースイソメラーゼ

                                       日本工業規格(日本産業規格)                             JIS
                                                                             K 7002-1988

工業用グルコース イソメラーゼ

Glucose Isomerase for Industrial Use

1. 適用範囲 この規格は,工業用グルコース イソメラーゼ(以下,グルコース イソメラーゼという。)
について規定する。
  引用規格 : 
    JIS K 8101 エタノール (99.5) [エチルアルコール (99.5)](試薬)
    JIS K 8258 カルバゾール(試薬)
    JIS K 8470 L-システィン一塩酸塩(1水化物)(試薬)
    JIS K 8824 ぶどう糖(無水)(試薬)
    JIS K 9009 りん酸二水素ナトリウム二水和物(試薬)
    JIS K 9019 りん酸水素二ナトリウム・12水(試薬)
    JIS R 3503 化学分析用ガラス器具
    JIS R 3505 ガラス製化学用体積計
2. 用語の意味 この規格で用いる主な用語の意味は,次のとおりとする。
(1) 異性化率 反応液中のぶどう糖とフラクトースとの和に対するフラクトースの重量割合。
(2) 最大活性 固定化酵素を反応塔に充てんし,所定の条件で通液運転を開始した後,最大流速を得ると
    きの酵素活性。
(3) 初期活性 酵素活性と通液時間との間の対数回帰式を用い,通液開始時間(0時間)に補外した酵素
    活性。
(4) 活性半減期 異性化率45%を得るための所定の条件下において,残存活性が初期活性の21となるまで
    の時間。
(5) 生産性 酵素1kgによって異性化された生産物(異性化率45%に換算したもの。)を乾燥質量 (kg) に
    よって表したもの。
3. 種類 グルコース イソメラーゼの種類は,次のとおりとする。
3.1   液状製品 微生物菌体内外から得られた酵素を精製した製品で,液状のもの。
3.2   固定化製品
(1) 微生物菌体又は酵素を結着剤を用いて固定化した製品。
(2) 微生物菌体又は酵素を包括剤を用いて固定化した製品。
(3) 微生物菌体又は酵素を担体を用いて固定化した製品。
(4) 微生物菌体又は酵素を結着剤,包括剤又は担体のうち2種類若しくは3種類を用いて固定化した製品。

――――― [JIS K 7002 pdf 1] ―――――

2
K 7002-1988
4. 品質 グルコース イソメラーゼの品質は,表のとおりとする。
                              表 グルコース イソメラーゼの品質
                             品質        液状製品        固定化製品
                             活性
                                        表示値以上          −
                            (U/ml)
                           最大活性
                                           −      表示値以上
                             (U/g)
                          活性半減期
                                           −      表示値以上
                             (h)
                            生産性         −      当事者間の協定による。
5. 試験の一般条件
5.1   試薬 試薬は,日本工業規格(日本産業規格)に適合する最上級品位のものを用いる。JISマーク表示許可品目として
指定されていない場合の試薬は,通商産業省の試薬表示認証制度に基づいて認証された最上級品位のもの
を用いる。
  なお,JISマーク表示品又は試薬表示認証制度に基づいて認証されたものがない場合は,試験に支障の
ないものを用いる。
5.2   ガラス器具類 ガラス器具類は原則としてJIS R 3503(化学分析用ガラス器具)及びJlS R 3505(ガ
ラス製化学用体積計)に規定されているものを用いる。
5.3   水 電気伝導率が5   一           下の蒸留水又はイオン交換水を用いる。
6. 試験方法
6.1   活性
6.1.1  試薬及び器具
(1) 試験管 外径25mm,長さ200mmの丸底のものであって,体積50mlの位置に標線の付いたもの。
      ただし,発色用に使用するものにあっては,標線のないもの。
(2) 恒温水槽 かくはん機付きて,60±0.5℃に保持できるもの。
(3) ぶどう糖溶液 (0.2mol/l)65℃,減圧下で5時間乾燥し,デシケーター中で放冷したJIS K 8824[ぶ
    どう糖(無水)(試薬)]1.8gを量り取り,全量フラスコ50mlに入れ,りん酸塩緩衝液 (0.2mol/l) (pH7.2)
    25m1及び硫酸マグネシウム溶液 (0.1mol/l) 5mlを加えて溶かし,りん酸塩緩衝液 (0.2mol/l) を標線ま
    で加える(1)。
(4) 試験用酵素液 酵素液1ml又は1gを取り,全量フラスコ100mlに入れ,りん酸塩緩衝液 (0.02mol/l) を
    標線まで加える。
      この液の一定量を全量ピペットを用いて取り,全量フラスコに入れ,りん酸塩緩衝液 (0.02mol/l) を
    標線まで加えて試験用酵素液とする。
(5) りん酸塩緩衝液 (0.2mol/l) (pH7.2)   JIS K 9009[りん酸二水素ナトリウム二水和物(試薬)]31.2gを
    量り取り,少量の水に溶かして全量フラスコ1 000mlに入れ,水を標線まで加える(A液)。
      別に,JIS K 9019[りん酸水素二ナトリウム・12水(試薬)]71.63gを量り取り,少量の水に溶かし
    て全量フラスコ1 000mlに入れ,水を標線まで加える(B液)。
      pH計を用いて混合液がpH7.2になるように,A液及びB液をよくかき混ぜなから合わせる。
(6) りん酸塩緩衝液 (0.02mol/l) りん酸塩緩衝液 (0.2mol/l) (pH7.2) 50mlを全量ピペットで取り,全量フ

――――― [JIS K 7002 pdf 2] ―――――

                                                                                              3
                                                                                    K 7002-1988
    ラスコ500mlに入れ,水を標線まで加える。
(7) 過塩素酸 (0.5mol/l)  過塩素酸(含量60%)27mlをビーカーに取り,水473mlを加える。
(8) 硫酸 (70%) 硫酸(含量97%以上)90mlを水38ml中に徐々に加える(1),(2)。
(9) システィン溶液 (1.5w/v%)   JIS K 8470[L-システイン−塩酸塩(1水化物)(試薬)]0.15gを水に溶
    かして10mlとする(1)。
(10) カルバゾールエタノール溶液 (0.12w/v%)   JIS K 8258[カルバゾール(試薬)]12mgをJIS K 8101〔エ
    タノール (99.5) [エチルアルコール (99.5)](試薬)〕に溶かして10mlとする。
(11) フラクトース溶液 (500 最一                  穎     した後,デシケーター中で放冷したフラクトース50mgを正
    確に量り取り,少量の水に溶かして全量フラスコ100mlに入れ,水を標線まて加える。冷暗所に保存
    する。
(12) フラクトース溶液 (10 最一             ‰   ラクトース溶液 (500  最一                              ピペッ
    スコ1 000mlに入れ,水を標線まて加える(1)。
    注(1) 使用時に調製する。
      (2) 急激な温度上昇を避けるため冷却しなから硫酸を加える。
6.1.2  操作
(a) ぶどう糖溶液 (0.2mol/l) 1mlを全量ピペットを用いて,標線の付いた試験管3本にそれぞれ入れ,60
    ±0.5℃に保った恒温水槽に5分間以上浸す。
(b) 試験用酵素液1mlを全量ピペットを用いて試験管3本のそれぞれに加え,振り混ぜた後,60±0.5℃に
    保った恒温水槽中に60分間浸す。
(c) 3本の試験管のそれぞれに過塩素酸 (0.5mol/l) 2mlを加えて反応を停止させ,直ちに氷浴中に5分間浸
    して冷却する。
(d) 3本の試験管のそれぞれに水を加え50mlとし,これを試料液とする。試料液は氷浴中に浸し冷却する。
(e) 標線のない試験管3本のそれぞれに試料液1mlを全量ピペットで取り,これらにシスティン溶液
    (1.5w/v%) 0.2mlを加え氷浴中に浸す。
(f) 氷浴中に浸したまま,3本の試験管のそれぞれに硫酸 (70%) 6mlを加え,十分に振り混ぜる。
(g) 氷浴中で5分間冷却した後,3本の試験管のそれぞれにカルバゾールエタノール溶液 (0.12w/v%) 0.2ml
    を加え,十分に振り混ぜる。
(h) 3本の試験管を,60±0.5℃に保った恒温水槽に10分間浸した後,直ちに氷浴中に2分間浸す。次に室
    温と同じ水温の水浴中に約5分間浸し,室温と同一温度とする。
(i) 10mmのセルを用いて波長560nm付近で吸光度を測定する。
(j) 水1ml及び (10   最一           ‰   ラクトース溶液1mlを試験管3本のそれぞれに全量ピペットを用いて取り,
    これらにシスティン溶液 (1.5w/v%) 0.2mlを加えた後氷浴中に浸し,(f),(g),(h)及び(i)の順で操作を行
    い,フラクトースの標準溶液の吸光度を測定する。
(k) (a)の操作に次いで過塩素酸 (0.5mol/l) 2mlを加えた後,(b),(d),(e),(f),(g),(h)及び(i)の順で操作
    を行い空試験とする。
6.1.3  計算 次の式によってグルコース イソメラーゼの活性 (U/ml) を算出する。ただし,酵素活性の
1単位 (1U) は,60℃,1分間に上記条件下で1                   ラクトースを生成する活性をいう。

――――― [JIS K 7002 pdf 3] ―――――

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K 7002-1988
                             A  B       1    1
                        U           50
                             F  N       60  180
                      ここに, U :  グルコース イソメラーゼの活性 (U/ml)
                                A :  反応液の吸光度(3本の平均値)
                                B :  空試験の吸光度(3本の平均値)
                                F :  (10  最一          ‰   ラクトース溶液の吸光度(3本の平均値)
                                N :  水の吸光度
6.2   最大活性
6.2.1  試薬及び器具
(1) ぶどう糖溶液(反応基質)(45w/w%) 無水結晶ぶどう糖(日本農林規格特級品)を用いて次の操作に
    よって調製したもの。
  (a) 無水結晶ぶどう糖4.5kgを60℃の水5 400mlに溶解し,60℃に保ちながら1時間以上かき混ぜる。
  (b) 25℃まで冷却した後,硫酸マグネシウム・七水和物2.05gを少量の水に溶かしたものを,かき混ぜ
      ながら加える。
  (c) 炭酸ナトリウム溶液 (8.3w/v%) (無水炭酸ナトリウム8.3gを水に溶解して100mlとしたもの。)を
      用いて所定のpHに調整する。
  (d) 屈折率計を用いて屈折率(3)を測定し,糖濃度を45w/w%に調整する。
    注(3) ぶどう糖溶液 (45w/w%) の屈折率は20℃の場合1.408 5,40℃の場合1.405 0である。
(2) 酵素剤 湿潤製品又は乾燥製品を次の操作によって調製したもの。湿潤製品にあっては約30ml,乾燥
    製品にあっては膨潤後カラムに充てんしたときの体積が約30mlとなる量を取り,これに反応基質約
    100mlを加えて,温水浴に浸して,約50℃に保ちながら減圧し30分以上脱気(4)する。乾燥酵素剤質
    量と充てん容積との関係は,乾燥酵素剤の適当量をカラムに充てんし,反応基質の通液を開始した後,
    1日経過し安定した固定化酵素床の高さと,カラムの内径とから求める。
    注(4) 脱気操作中に突沸,発泡などによって酵素剤が失われないよう注意しながら行う。
(3) 異性化装置 次に示す仕様の送液ポンプ,カラム及び恒温水槽で構成されたもの。構成例を図に示す。
  (a) 送液ポンプ 流速の調節が毎時20200mlの範囲内で可能であって,流速の変動が±2%以内のもの。
  (b) 異性化カラム 内径15mm,長さ400mmのガラス製であって,カラムの上下には,酵素剤の流失を
      防止するためのフィルタの設置,上下端末はゴム管,塩化ビニル管などのチューブの接続及び60℃
      に保つためのジャケットをもつ構造のもの。
  (c) 恒温水槽 異性化カラムを60±0.5℃に保温するための温水の調製に用いるもので,水温の変動が±
      0.5℃以内に調節できるもの。

――――― [JIS K 7002 pdf 4] ―――――

                                                                                              5
                                                                                    K 7002-1988
                                 図 異性化装置の構成(一例)
6.2.2  操作
(a) 異性化カラムに反応基質を用いて6.2.1(2)で説明した酵素剤約30mlを流し込み(5),酵素剤上部の空間
    にガラスウールをゆるく充てんする。
(b) 反応基質を送液ポンプを用いて,異性化カラムの上部から下向流で通液する。流出液中のぶどう糖量
    又はフラクトース量を1日1回以上測定し異性化率を求め,異性化率が0.400.45の範囲に入るよう
    に流速を設定する。
(c) 異性化率を液体クロマトグラフ,旋光度又はシスティン−カルバゾール法によって測定する。
    注(5) 気泡が混入しないように注意して行う。
6.2.3  計算 次の式によってグルコース イソメラーゼの活性 (E) を求め,活性 (E) の最大値 (Emax) を
最大活性とする。
                             FS          .051
                         E       .051ln
                             W         .051 X
                      ここに,   E :  酵素活性(6) (U/g)
                                 F :  流速 (ml/min)
                                  S :  反応基質の濃度 (         一           2.98mmol)
                                 W :  酵素量 (g)
                                 X :  異性化率 (−)
    注(6) 単位体積当たりの酵素活性を求める場合には,6.2.1(2)(a)で求めた酵素質量と充てん体積の関係
          から計算によって求める。
6.3   活性半減期
6.3.1  試薬及び器具
  (1) ぶどう糖溶液(反応基質)(45w/w%)  6.2.1(1)と同じ。
  (2) 酵素剤 6.2.1(2)と同じ。
  (3) 異性化装置 6.2.1(3)と同じ。
6.3.2  操作 6.2.2(a)(c)に準じて,流量が最大活性の21となるまで操作を続ける。
6.3.3  計算 6.2.3(a)(c)に準じて,酵素活性を計算し,通液時間との間の対数回帰式を求める。初期活
性は,対数回帰式から通液開始時間(0時間)に補外した酵素活性をいう。活性半減期は,初期活性が21に
なる時間をいう。

――――― [JIS K 7002 pdf 5] ―――――

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